各省、自治區(qū)、直轄市植保(植檢、農(nóng)技)站(局、處、中心)，天津市、遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)技推廣總站：

根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第351號(hào)，梨火疫病菌、馬鈴薯金線蟲、玉米褪綠斑駁病毒等3種有害生物新增補(bǔ)為全國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物。為做好新增補(bǔ)有害生物監(jiān)測工作，我中心組織制定了《梨火疫病菌監(jiān)測調(diào)查方法(試行)》《馬鈴薯金線蟲監(jiān)測調(diào)查方法(試行)》《玉米褪綠斑駁病毒監(jiān)測調(diào)查方法(試行)》，現(xiàn)印發(fā)各地試行。試行中相關(guān)問題建議請及時(shí)反饋我中心植物檢疫處。

聯(lián) 系 人：王曉亮

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梨火疫病菌監(jiān)測調(diào)查方法(試行)

為做好梨火疫病菌(Erwinia amylovora Burrill et al.)監(jiān)測調(diào)查工作，制定本方法。

一、監(jiān)測區(qū)域

梨火疫病菌發(fā)生縣(區(qū))及傳入風(fēng)險(xiǎn)高的未發(fā)生縣(區(qū))。發(fā)生縣(區(qū))重點(diǎn)監(jiān)測有代表性果園和邊緣區(qū)果園，未發(fā)生縣(區(qū))重點(diǎn)監(jiān)測寄主作物采穗圃和苗圃、與發(fā)生縣(區(qū))相鄰的周邊果園等。監(jiān)測調(diào)查作物包括梨、蘋果、杜梨、山楂、海棠、榅桲等薔薇科果樹、砧木等，以及其它仁果類植物。

二、監(jiān)測時(shí)間

1. 果園。發(fā)生縣在果樹開花期到果實(shí)膨大中期(一般為 4月—7 月)，尤其是雨后或澆水后，每 15 天調(diào)查一次;秋花、秋果或秋稍期(一般為 9 月)調(diào)查 1 次。未發(fā)生縣全年踏查 2 次。

2. 采穗圃或苗圃。全年踏查 2—3 次。

三、監(jiān)測方法

在訪問調(diào)查和踏查基礎(chǔ)上，對發(fā)現(xiàn)疑似疫情的果園、采穗圃或苗圃，按以下方法進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)測。

(一)取樣方法

1. 果園。果園面積小于 50 畝的設(shè)臵 1 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)地進(jìn)行調(diào)查，面積每增加 50 畝增設(shè) 1 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)地，標(biāo)準(zhǔn)地面積不少于 5 畝，在標(biāo)準(zhǔn)地內(nèi)隨機(jī)抽取或采取平行線法選取寄主樹作為調(diào)查株。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)地調(diào)查株數(shù)不少于 100 株。標(biāo)準(zhǔn)地累計(jì)面積原則上不應(yīng)少于— 3 —總面積的 5%，抽取標(biāo)準(zhǔn)株不少于標(biāo)準(zhǔn)地總株數(shù)的 20%。

2. 采穗圃或苗圃。每個(gè)采穗圃或苗圃采用對角線取樣或棋盤式取樣，選取若干個(gè)樣方(靠近圃地邊緣的樣方應(yīng)距離邊緣 2—3 米)。樣方累計(jì)面積不少于栽培面積的 3%。樣方應(yīng)在 10 平方米以上，每個(gè)樣方上的植株應(yīng)在 100 株以上。每個(gè)樣方按對角線取樣或棋盤式取樣，選取調(diào)查樣株，調(diào)查樣株不少于樣方總株數(shù)的 10%。對于大苗或綠化苗，可適當(dāng)擴(kuò)大樣方面積和抽樣比例，也可采取隨機(jī)抽取樣株的方法進(jìn)行，但樣方累計(jì)面積不少于栽培面積的 3%，樣株數(shù)量不少于苗圃估計(jì)總數(shù)量的 10%。

(二)調(diào)查方法

1.開花期。重點(diǎn)調(diào)查是否有花腐癥狀?；ǜ跗跒樗疂n狀病斑，花基部或花柄呈暗色，逐漸變褐色或黑褐色，不久萎蔫。病菌可由單朵花擴(kuò)展至花梗及花簇中其它的花。在溫暖潮濕的條件下，花梗上會(huì)有菌膿滲出。

2.果實(shí)膨大期。重點(diǎn)調(diào)查嫩梢、枝干、果實(shí)癥狀。嫩梢最易受侵染，最初癥狀是梢表皮發(fā)黑，后葉片、枝尖萎蔫，但萎蔫前不褪色，呈拐杖狀，潮濕時(shí)，枝條、葉柄上出現(xiàn)菌膿，幾天內(nèi)即可造成整枝的死亡。隨著病菌不斷深入和侵染主干，皮層收縮、下陷，會(huì)形成潰瘍斑。幼果在感病初期果實(shí)呈水漬狀，濕度大時(shí)可見大量乳白色至褐色的菌膿，發(fā)病后期變黑褐色，呈僵果狀。

3. 苗期。重點(diǎn)調(diào)查嫩梢是否出現(xiàn)“牧羊鞭”癥狀。

四、鑒定方法

(一)樣品采集。將田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)疑似癥狀的植株進(jìn)行取樣，若有條件，可采用梨火疫病快速檢測試紙條做初篩，陽性樣品作為重點(diǎn)樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測。采集樣本裝在牛皮信封內(nèi)，記錄采集時(shí)間、地點(diǎn)、采集人、發(fā)病癥狀及發(fā)病面積等信息。

(二)免疫學(xué)檢測。采用商品化 ELISA 方法進(jìn)行檢測，按照說明書進(jìn)行操作及結(jié)果判定。若檢測結(jié)果為陰性，判定為未檢出梨火疫病菌。若檢測結(jié)果為陽性，且有典型癥狀，判定為檢出梨火疫病菌;若檢測結(jié)果為陽性，而癥狀非典型，需進(jìn)行分離培養(yǎng)及致病性測定鑒定。

(三)分子生物學(xué)檢測。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件，可選擇 PCR 凝膠電泳檢測、實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測等。檢測結(jié)果若為陰性，判定為未檢出梨火疫病菌。若檢測結(jié)果為陽性，且有典型癥狀，判定為檢出梨火疫病菌;若檢測結(jié)果為陽性，而癥狀非典型，需進(jìn)行分離培養(yǎng)及致病性測定鑒定。

(四)分離培養(yǎng)鑒定。將制備樣品懸浮液或樣品富集培養(yǎng)液，在 LB 培養(yǎng)基平板上劃線分離，菌落白色，較大而凸起。在 25℃恒溫培養(yǎng) 24 —48 小時(shí)，挑取可疑單菌落進(jìn)行純化，轉(zhuǎn)接 2—3次，隨后進(jìn)行致病性測定、Biolog 鑒定、免疫學(xué)或分子生物學(xué)鑒定。

(五)Biolog 鑒定。利用 Biolog 微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)對分離純化的菌株進(jìn)行鑒定，按照說明書進(jìn)行操作及結(jié)果判定。

(六)致病性測定。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件，可選擇杜梨苗、未成熟梨幼果接種試驗(yàn)或枝梢接種試驗(yàn)，進(jìn)行致病性測定。調(diào)運(yùn)相關(guān)物品的梨火疫病菌檢測參照上述方法進(jìn)行。

五、結(jié)果記錄與保存

田間調(diào)查結(jié)果填入《梨火疫病菌田間調(diào)查記錄表》(附表)，調(diào)查結(jié)果和檢測樣品妥善保存于植物檢疫機(jī)構(gòu)備查。

來源：全國農(nóng)技中心